原来检测细胞增殖，方法这么多（上）

导读

上期我们详细介绍了评价细胞增殖能力之克隆形成实验，但一经查阅文献，殊不知原来相关检测方法居然还有10余种，如MTT、MTS、CCK8、SRB及DNA合成检测和ATP浓度检测等等，那在这些方法中我们该作何选择，确实是个头大的难题。本期我们就一起看看究竟哪一种方法最适合你的？

细胞增殖检测实验的意义

细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。

肿瘤细胞增殖和转化过程

细胞增殖检测实验的分类

细胞增殖检测实验根据实验方案和目的不同分为以下几种：

1. 细胞代谢活性检测  通过检测活细胞相关的物质的含量（如蛋白质、酶）等间接地测定待活细胞的数量来评价细胞的增殖能力。

• 特点：间接的方法，反应的是细胞活性而非是否在增殖；

• 常见实验举例：MTT、XTT、MTS、CCK8法及SRB法；

• 应用：细胞活力、药物作用的毒性，适合高通量分析实验。

2. 细胞DNA合成检测   通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力。

• 特点：直接测定DNA合成是检测细胞增殖最准确方法；

• 常见实验举例：BrdU和EdU；

• 应用：细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等。

3. ATP浓度检测  利用荧光素酶Luciferase反应细胞ATP的含量，进而反应细胞活性。

• 特点：结果灵敏；

• 常见实验举例：荧光素酶催化反应；

• 应用：高通量细胞增殖检测和筛选。

4. 细胞增殖相关抗原检测  通过检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA等常作为人体细胞增殖的标志。

• 特点：反应体内肿瘤细胞的增殖能力，但是需组织切片不适合高通量；

• 常见实验举例：细胞增殖的标志物的免疫组化等；

• 应用：体内肿瘤组织。

5. 染料排斥法  活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。适合少量细胞的统计，广泛用于绘制细胞生长曲线等。

以上方法我们一般是根据你的实验目的，细胞类型来决定最终的选择。

本期我们先为大家介绍了一下，第一大类：基于细胞代谢活性的检测：包括酶活如MTT、MTS、CCK8等；蛋白含量的SRB实验。又可统称为比色法，主要基于颜色的变化来反应细胞数量，十分适合高通量药物筛选，进而计算药物的IC50。

第一类：MTT、MTS、CCK8等

这一类的实验原理基本类似，细胞线粒体的脱氢酶可将MTT、MTS、CCK8等试剂还原为有色产物，可在酶标仪上于不同波长（490nm、490nm、450nm）处检测OD值，在一定范围内，吸光度值与活细胞数目成正比，进而反应细胞数量。

MTT是最早出现的检测方式，于1983年由Mosmann建立的方法，MTT为四唑盐，但是存在一定的缺陷，特别是还原产物不溶水，且对细胞有较大毒性，因此限制了其使用，目前基于MTT开发的MTS、CCK8等，应用更加广泛。

MTT对细胞的毒性：

A图为刚加入MTT（0.5mg/ml）NIH-3T3细胞形态，B图为加入MTT后4h，细胞形态发生了明显改变[1]。

如下为MTS的原理：MTS被乳酸脱氢酶还原为黄色的Formazan

1. MTS的操作步骤：

1.  细胞接种到96孔板培养；
   

2. 37℃培养箱培养几天；

3.  培养完成后，每孔加入MTS和PMS（20:1比例）混合溶液后继续孵育2-3h，现在大部分公司提供的商品化MTS已处理好可以直接加入进行检测；

4.  终止培养，使用酶标仪，在490nm处测定吸光度值；

注意：避光操作。为了保证实验结果有良好的线性，MTS实验中吸光度值应保持在0.75-1.25之间较好；肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。

优点：

1. 操作简单，比MTT高效，产生水溶性的Formazan，无需用DMSO溶解；

2. 由于MTS被还原产物颜色较深，吸光度值变异范围大，使测定更加敏感准确；

3. 快速，作用时间2-3小时为最佳，而MTT需4小时；

4. 重复性好，还原产物稳定。

2. CCK8法的操作步骤：

1.  细胞接种到96孔板培养；
   

2.  培养完成后，每个孔中加入10μLCCK8试剂；

3.  37℃培养箱中孵育1-4h；

4.  使用酶标仪，在450nm处测定其吸光度值。

优点：

1. 使用方便，检测快速；

2. 灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；

3. 对细胞毒性小；

4. 产物水溶性，不需换液，尤其适用于悬浮细胞。

缺点：与MTT相比，CCK-8和MTS的价格贵。

注意：避光操作。

第二类：SRB比色法

SRB磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B)，一种粉红色阴离子染料，在酸性条件下可特异性地与细胞内碱性氨基酸结合；在540 nm波长下产生吸收峰，在一定范围内，吸光度值与活细胞数目成正比。

实验步骤：

1. 从培养箱中取出培养好的待检测细胞量的96孔板样品；

2. 每孔加入TCA（50%的三氯乙酸）固定细胞，4℃放置1h；

3. 弃去固定液，蒸馏水洗5-6次，室温晾干或吹风机吹干；

4. 每孔中加入SRB染液100μL，室温放置10-30min；

5. 弃去染液，用1%醋酸洗涤，直至在白色纸上倒扣轻拍无明显染料颜色；

6. 每孔加入150μLTris溶液；

7. 用酶标仪在515nm处测定吸光度值；

注意：SRB实验结果中OD值在0.8-1.2之间时线性较好；肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。

优点：不存在孵育时间限制，即细胞固定后以放置较长时间；与MTS,CCK8相比，检测时间可以自己掌握，不受限制，更适合大规模试验。

缺点：操作步骤繁琐，不适合悬浮细胞。

如下图，图A表示肺癌细胞系H441细胞数量与SRB染料对应的吸光度值成线性关系，B图显示SRB方法来测试miRNA对两株肺癌细胞细胞系的增殖影响[2]。

常见问题汇总

MTS、CCK8及SRB法等方法，如何确定选择哪个？

大家可根据实验要求和预算进行选择，价格方面，CCK8和MTS大于SRB，但是SRB操作较繁琐，但个人觉得SRB线性更好，但不适用于悬浮细胞。

OD不在线性范围内，怎么办？误差大吗？

如MTS要求0.8，（通常来说，比色法测定细胞增殖试剂盒中都会注明最佳反应时间，通常MTS/CCK8反应最佳时间为1h-4h，我们实验初期固定孵育时间如1h，通过比较不同细胞量的OD值来确定实验细胞铺板量，根据具体情况进行调整。

对细胞密度有要求吗？

不同类型的细胞，代谢活性不同，影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。细胞在高细胞密度时会产生接触抑制，进而代谢活性降低，导致细胞数和吸光度值的非线性关系。对大多数肿瘤细胞，杂瘤细胞和纤维母细胞系，推荐5000cells/孔作为增殖研究的起始细胞数，虽然少于1000个细胞通常也可被检测。血淋巴细胞例外，一般需要25,000–250,000细胞/孔才能获得足够的吸光值。可以参考下图的实验来确定细胞数。

 本期我们就为大家介绍到这这里了，主要讲述了比色法的几种常见实验，我们要根据自己实验目的和细胞类型来选择最合适自己的方法。下一期我们继续为大家介绍剩余的几种检测方法。

参考文献

1. Riss T L, Moravec R A, Niles A L, et al. Cell viability assays[J]. 2016.

2. Kasinski A L, Kelnar K, Stahlhut C, et al. A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J]. Oncogene, 2015, 34(27): 3547-3555

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